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干货 ▎RT-qPCR 实验原理简单分析
人阅读 发布时间：2022-05-17 14:30
RT-qPCR，定量逆转录 PCR（quantitative reverse transcription PCR）是以 RNA 为模板，首先通过逆转录酶转录为 cDNA，然后 Taq DNA 聚合酶以 cDNA 为模板完成荧光定量扩增实验的分析方法。
RT-qPCR 按操作方法不同，可以分为一步法和两步法。两步法 RT-qPCR，逆转录和 qPCR 扩增过程是分为两步完成，在不同的管子中，使用不同的优化的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略完成反应。一步法 RT-qPCR，逆转录与 PCR 扩增结合在一起，使逆转录酶与 DNA 聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。与传统两步法相比，一步法 RT-qPCR 操作更简单，污染风险更小，实验结果重复性更好，例如，新冠核酸检测利用的就是一步法定量逆转录 PCR 技术。
RT-qPCR 按操作方法不同，可以分为一步法和两步法。两步法 RT-qPCR，逆转录和 qPCR 扩增过程是分为两步完成，在不同的管子中，使用不同的优化的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略完成反应。一步法 RT-qPCR，逆转录与 PCR 扩增结合在一起，使逆转录酶与 DNA 聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。与传统两步法相比，一步法 RT-qPCR 操作更简单，污染风险更小，实验结果重复性更好，例如，新冠核酸检测利用的就是一步法定量逆转录 PCR 技术。
一步法与两步法 RT-qPCR 示意图
RT-qPCR 逆转录过程
模板
成功的 cDNA 合成来自高质量的 RNA。高质量的 RNA 至少应保证全长共且不含逆转录酶的抑制剂，如 EDTA 或 SDS。RNA 的质量决定了你能够转录到 cDNA 上的序列信息量的最大值。一般的 RNA 纯化方法是使用异硫氰酸胍/酸性酚的一步法。为了防止痕量 RNase 的污染，从富含 RNase 的样品（如胰脏）中分离到的 RNA 需要贮存在甲醛中以保存高质量的 RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的 RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的 RNA，在甲醛中保存 3 年仍保持稳定。另外、长度大于 4kb 的转录对于痕量 RNase 的降解比小转录更敏感。为了增加贮存 RNA 样品的稳定性，可以将 RNA 溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存 RNA 的甲酰胺一定不能含有降解 RNA 的杂物。来遵于胰脏的 RNA 至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用 RNA 时。可以使用下列方法沉淀 RNA∶加入 NaCI 至 0.2M 及 4 倍体积的乙醇，室温放置 3-5 分钟，10，000xg 离心 5 分钟。
逆转录引物
在两步法中，有三种不同的方法可用于引发 cDNA 反应：随机六聚体引物、Oligo(dT) 引物或序列特异性引物。
●随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA。用此种方法时，体系中所有 RNA 分子全部充当了 cDNA 第一链模板，PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96% 来源于 rRNA。
● Oligo（dT）：是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有 3' 端 Poly（A）尾，此引物与其配对，仅 mRNA 可被转录。由于 Poly（A）RNA 仅占总 RNA 的 1-4%。故此种引物合成的 cDNA 比随机六聚体作为引物和得到的 cDNA 在数量和复杂性方面均要小。
●序列特异性引物∶最特异的引发方法是用含目标 RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物，若 PCR 反应用这种特异性引物，第一条链的合成可由与 mRNA3' 端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的 cDNA，导致更为特异的 PCR 扩增。
●随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA。用此种方法时，体系中所有 RNA 分子全部充当了 cDNA 第一链模板，PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96% 来源于 rRNA。
● Oligo（dT）：是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有 3' 端 Poly（A）尾，此引物与其配对，仅 mRNA 可被转录。由于 Poly（A）RNA 仅占总 RNA 的 1-4%。故此种引物合成的 cDNA 比随机六聚体作为引物和得到的 cDNA 在数量和复杂性方面均要小。
●序列特异性引物∶最特异的引发方法是用含目标 RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物，若 PCR 反应用这种特异性引物，第一条链的合成可由与 mRNA3' 端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的 cDNA，导致更为特异的 PCR 扩增。
逆转录酶
● Money 鼠白血病病毒（M-MLV）逆转录酶∶有强的聚合酶活性，RNA 酶 H 活性相对较弱，最适作用温度为 37℃。
●禽成髓细胞瘤病毒（AMV）逆转录酶∶有强的聚合酶活性和 RNA 酶 H 活性，最适作用温度为 42℃。
●Thermus thermophilus、Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性逆转录酶∶存 Mn2+存在下，允许高温反转特录 RNA，以消除 RNA 模板的二级结构。
●M-MLV 逆转录酶的 RNase H-突变体∶商品名为 SuperScript 和 SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能够将更大部分的 RNA 转换成 cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温逆转录很困难的 mRNA 核板合成较长 cDNA。
●禽成髓细胞瘤病毒（AMV）逆转录酶∶有强的聚合酶活性和 RNA 酶 H 活性，最适作用温度为 42℃。
●Thermus thermophilus、Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性逆转录酶∶存 Mn2+存在下，允许高温反转特录 RNA，以消除 RNA 模板的二级结构。
●M-MLV 逆转录酶的 RNase H-突变体∶商品名为 SuperScript 和 SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能够将更大部分的 RNA 转换成 cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温逆转录很困难的 mRNA 核板合成较长 cDNA。
RT-qPCR 中逆转录过程示意图
东盛生物有两款逆转录酶可供选择，可满足不同实验设计的需要：
| 名称 | 特点 | 应用类型 | 货号/规格 |
| Gold逆转录酶 | 最佳活性温度50~55℃ | 逆转录，尤其是一步法的RT-qPCR | R3001/2,000U R3002/10,000U |
| M-MLV逆转录酶 | 最佳活性温度37~42℃ | 两步法的逆转录 | R1041/5,000U R1042/10,000U |
RT-qPCR 的 qPCR 过程
引物设计
用于 RT-qPCR 中 qPCR 步骤的 PCR 引物最好应设计成跨越一个外显子-外显子连接，其中一条扩增引物可以潜在地跨越实际外显子-内含子边界。由于含内含子的基因组 DNA 序列不会被扩增，因此这种设计可以减少从污染的基因组 DNA 中扩增得到的假阳性的风险。如果引物不能被设计成能够分离外显子或外显子-外显子边界，则有必要利用无 RNA 酶的 DNA 酶 I 或 dsDNA 酶处理 RNA 样品以除去基因组 DNA 污染。
RT-qPCR 中 qPCR 步骤的引物设计。1）如果一个引物被设计为跨越外显子-内含子边界，则可能造成污染的基因组 DNA 将不会被扩增，其原因是引物不能退火至该基因组 DNA 模板。相反，cDNA 不含任何内含子，能够有效被引物识别并扩增。2）当引物侧接一个长的内含子（例如1 kb），扩增反应将不会发生，因为短的延伸时间仅够用于扩增短的 cDNA，却不足以扩增基因组靶基因。
检测方法
SYBR GreenⅠ法：在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料，SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。
TaqMan 探针法：探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq 酶的 5』-3』外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物的形成完全同步。
东盛生物提供多种高品质一步法 RT-qPCR 试剂（见下表），产品性能卓越、稳定。
2 种形式可供选择，创新冻干粉形式，更易运输储存；传统溶液形式，使用更方便。
可满足不同实验设计的需求，便于科研同事和工业客户选择。
TaqMan 探针法：探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq 酶的 5』-3』外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物的形成完全同步。
东盛生物提供多种高品质一步法 RT-qPCR 试剂（见下表），产品性能卓越、稳定。
2 种形式可供选择，创新冻干粉形式，更易运输储存；传统溶液形式，使用更方便。
可满足不同实验设计的需求，便于科研同事和工业客户选择。
| 货号 | V5005/V5006 | V5005L/V5006L | V5007/V5008 | V5007L/V5008L | V5009/V5010 |
| 产品名称 | DSPathTM 4X One-Step Multiplex Master Mix | DSPathTM 4X One-Step Multiplex Master Mix（冻干粉） | 2X One Step Prime RT-qPCR Mix | 2X One Step Prime RT-qPCR Mix（冻干粉） | One-step Probe RT-qPCR Kit V2 |
| 预混形式 | 4X All-in Mix | 4X冻干粉All-in Mix | 2X All-in Mix | 2X冻干粉All-in Mix | 酶Mix+2X Buffer Mix |
| 运行模式/时间 | Fast/~60 min or Standard/~120 min | Fast/~60 min or Standard/~120 min | Fast/~60 min or Standard/~120 min | Fast/~60 min or Standard/~120 min | Fast/~60 min or Standard/~88 min |
| 所含反转录酶/最佳反应温度 | 耐热反转录酶/48~55℃ | 耐热反转录酶/48~55℃ | 耐热反转录酶/48~55℃ | 耐热反转录酶/48~55℃ | 耐热反转录酶/50~55℃ |
| 所含PCR 酶 | 抗体修饰热启动酶 | 抗体修饰热启动酶 | 抗体修饰热启动酶 | 抗体修饰热启动酶 | 抗体修饰热启动酶 |
| 热敏UDG酶 | + | + | + | + | + |
| 灵敏度 | 很高 | 很高 | 很高 | 很高 | 超高 |
产品优势：
1.含耐热反转录酶，高效反转录病毒 RNA，保证后续定量 PCR 检测的效率。
2.添加热敏型 UDG 酶，有效消除假阳性污染，提高检测结果的准确度，防止漏检。
3.含高特异性抗体修饰热启动 Taq 酶，灵敏检测多重靶标，是新冠或其他疫病核酸检测试剂盒（荧光 PCR 法）的核心原料。
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